Текст работы

Министерство образования Республики Беларусь
Учреждение образования
Международный государственный экологический университет
имени А.Д. Сахарова
Факультет экологической медицины
Кафедра биохимии и биофизики

Курсовая работа
Оценка токсичности наночастиц серебра in vitro

студентки
Чечотко Анны Ивановны

Минск 2014
Реферат

Курсовая работа страниц, 5 рисунков, 3 таблицы, 20 источников.
ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА IN VITRO
Объектом исследований являются наночастицы серебра, методы определения токсичности наночастицы серебра in vitro.
Цель исследования: разработать методологические подходы к определению токсичности наночастицы серебра для гигиенической оценки их безопасности.
В процессе выполнения решались следующие задачи: разработать тест-модель для оценки токсичности наноматериалов in vitro; разработать алгоритм исследований токсичности наноматериалов in vitro; обосновать критерии оценки токсичности наноматериалов in vitro.
В ходе выполненной курсовой работы был выбран вид наноматериала (наночастицы серебра) для проведения тестирования in vitro; определены клеточные линии для изучения цитотоксического действия наночастиц с учетом возможных органов-мишеней; проведен анализ научной литературы, касающейся методических аспектов изучения цитотоксического действия наноматериалов для токсикологической оценки. В экспериментах определены приемлемые диапазоны концентраций наночастиц для тех или иных методов исследования.

Список сокращений

АОЗ - антиоксидантная защита
АФК - активные формы кислорода
АТФ - аденозинтрифосфат
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ЖКТ - желудочно-кишечный тракт
ЛДГ - лактатдегидрогеназа
НМ - наноматериалы
НЧ - наночастицы
ЦНС - центральная нервная система
ЭФК - эмбриональные фибробласты крысы- эмбриональные фибробласты мыши- (4, 5-диметил-2-тиазолил)-2, 5-дифенил-2H-тетразолия бромид, редокс-краситель
UFPs - ультратонкие частицы

Оглавление

Введение
.Наночастицы
.1Состояние проблемы
.2Определение наночастиц
.3Классификация наночастиц
.4Свойства наночастиц
.5Пути поступления и биокинетика наночастиц
.6Системные эффекты наночастиц
.7Исследование цитотоксичности наночастиц
.Объекты, методы исследований, приборы, оборудование
.1Наночастицы, используемые в экспериментах in vitro
.1.1 Характеристика наночастиц серебра
.2Культуры клеток, используемые для изучения токсичности in vitro
.2.1Культура клеток карциномы легкого человека (А549)
.2.2Культура клеток амниона человека, сублиния FL
.2.3Культура лимфоцитов человека
.2.4Культура кардиомиоцитов крыс линии SHR
.3Методы изучения цитотоксичности наноматериалов в культурах клеток млекопитающих
.3.1Метилтетразолиевый тест
.3.2Метод оценки жизнеспособности клеток в культуре с помощью окраски трипановым синим (метиленовым синим)
.3.3Метод оценки жизнеспособности клеток в культуре с помощью определения активности ЛДГ
.4Перечень испытательного оборудования
.Результаты исследований
.1Влияние наночастиц серебра на жизнеспособность клеток линий А549, SHR и сублинии FL по результатам МТТ-теста
.2Влияние наночастиц на жизнеспособность лимфоцитов человека по результатам МТТ-теста
.3Изучение цитотоксичности наноматериалов для клеток линии А549 с помощью окраски метиленовым синим
.4Изучение жизнеспособности клеток в культуре по активности лактатдегидрогеназы в среде культивирования
Заключение
Список литературы
наночастица серебро лимфоцит токсичность
Введение

В последние два десятилетия в научную лексику стремительно «ворвались» ряд новых слов с префиксом «нано»: наноструктура, нанотехнология, наноматериал, нанокластер, нанохимия, наноразмерный материал, наноколлоиды, нанореактор и т.п. Издается ряд новых журналов, посвященных исключительно этой тематике, появились монографии, в названии которых присутствует префикс «нано», а также «нано» - профилированные институты, кафедры и отдельные лаборатории, проводятся многочисленные конференции.
В настоящее время в Республике Беларусь выполняется Государственная комплексная программа «Нанотехнологии и наноматериалы», которая предполагает разработку сверхтвердых, тугоплавких, магнитных и композиционных наноматериалов, наноэлектроники, а также изучение физико-химических особенностей наноразмерных величин. Детально изучается влияние нанодобавок на свойства металлов, сплавов, пластмасс, резины, керамики. Преимущество модифицированных материалов - в их высокой прочности и износостойкости, а также хорошем коэффициенте трения.
Разработка новых наноматериалов, рост производства и расширение возможностей их применения неминуемо приведет к увеличению их воздействия на население и окружающую среду. Становится очевидным, что для обеспечения безопасного обращения наноматериалов необходимо понимание возможных эффектов производимых и используемых в различных товарах наноматериалов на различных уровнях организации живых систем, характеристика воздействия и оценка риска на каждом этапе жизненного цикла товара или материала. Важная составляющая таких знаний - результаты токсикологической оценки наночастиц, а именно выявление зависимостей доза-эффект, доза-время-эффект с учетом природы и размера наночастиц, что является предметом изучения нанотоксикологии.
1. Наночастицы

.1Состояние проблемы

Число наименований наноматериалов и объемы их применения в различных областях науки, медицины, энергетики, промышленности стремительно растут. Скорость развития нанотехнологий опережает разработку методов оценки их безопасности и регламентирующих документов [1]. В настоящее время практически не проводятся исследования потенциальных токсических свойств наноматериалов.
Негативные эффекты наночастиц зависят от пути воздействия и включают цитотоксичность, развитие неспецифических воспалительных реакций и окислительного стресса, онкогенность.
Оценка токсического действия наночастиц различного химического состава и структуры является актуальной и своевременной. Установление принципов и процедур тестирования с целью обеспечить безопасное производство и применение наноматериалов на рынке необходимо и достижимо [2]. Исследования с целью разработки адекватных подходов к прогнозу риска влияния наночастиц на здоровье человека с учетом химической структуры, размеров, формы, физико-химических свойств, технологии производства и сферы применения на начальном этапе целесообразно проводить in vitro.
Проблема токсического действия наночастиц на живые системы не является абсолютно новой. По определению наночастицы - объекты, один из размеров которых составляет 40 нм по размеру сопоставимы с большими протеинами, могут формировать с ними различные комплексы в зависимости от свойств поверхности. Комплексы могут иметь другую биокинетику, активность и даже функцию. Если частица не распадается и ее размер свыше 5 нм, наночастица не может быть выведена через почки и, таким образом, может вызвать более выраженные повреждающие эффекты в организме. Высвобождение медиаторов воспаления вследствие накопления наночастиц в легких может стать причиной гиперкоагуляции крови и увеличить кардиоваскулярный риск. Развитие атеросклероза также связывают с воздействием наночастиц. Наночастицы способны преодолевать гематоэнцефалический барьер и проникать в ЦНС.
Основной путь воздействия UFPs ингаляционный. Считается, что размер UFPs позволяет им долгое время оставаться в воздухе, попадать в нижние отделы дыхательных путей, проникать в межклеточное пространство, что препятствует выведению из организма. UFPs, даже если по химическому составу не являются токсичными, могут вызвать окислительный стресс [12], высвобождение медиаторов воспаления и способствовать возникновению заболеваний легких и других системных эффектов [13, 14].
Воздействие на человека может быть профессиональным, непосредственно в процессе производства, либо опосредованно через контаминацию воздуха рабочей зоны или офисного помещения [15], а также случайным, в результате загрязнения атмосферного воздуха, эмиссии побочных продуктов [16]

.7Иисследование цитотоксичности наночастиц

Реализация токсичности наноматериалов обеспечивается следующими свойствами: физическое сродство к биологическим структурам, например посредством электростатического или гидрофобного взаимодействия; каталитическиие свойства, с активацией окислительно-восстановительных реакций, например индукция молекул кислорода и воды с образованием АФК; распад наночастиц с образованием токсичных соединений
К основным проблемам токсичности наноматериалов можно отнести следующие. Во-первых токсичность наночастиц не может быть производной токсичности аналогов в макродисперсной фазе или в форме сплошной фазы, а во-вторых, имеющиеся токсикологические методологии основаны на определении токсичности вещества относительно массовой концентрации, что не приемлемо для наноматериалов, для которых определяющим свойством может быть площадь поверхности или число наночастиц.
Недавние инновации в науке и технике позволили разработать ряд тестов in vitro, позволяющих прогнозировать токсичность для животных. Поскольку требования для тестирования наноматериалов еще законодательно не установлены, ученые имеют возможность осуществлять поиск методов, основанных на новейших достижениях науки и применять их на практике.
Многие модели in vitro превосходят методы изучения токсичности, основанные на использовании животных, которые традиционно применялись в области токсикологии. Модели с использованием животных не только негуманны, но и часто недостаточно надежны с точки зрения прогнозирования эффектов у человека. Область нанотоксикологии обязана включить доступную технологию. Далее представлены наиболее многообещающие методы in vitro, доступные в настоящее время для проведения оценки безопасности наноматериалов.
Для изучения действия наноматериалов на типы клеток, соответствующие «входным воротам», применяется ряд методов, позволяющих определить цитотоксичность, способность наноматериалов вызывать воспаление, окислительный стресс, а также генотоксичность.
Токсические эффекты НЧ связывают, в первую очередь, с формированием окислительного стресса и накоплением свободнорадикальных продуктов [17].
Методы in vitro на культурах клеток позволяют изучить: окислительный стресс и АОЗ, воспаление, жизнеспособность клеток, пролиферацию, апоптоз, некроз, нарушение функции митохондрий, влияние на мембраны, клеточную локализацию наночастиц.
Тесты на цитотоксичность традиционно используют в фармацевтической промышленности для скрининга биологически активных соединений. В настоящее время их широко применяют для оценки наноматериалов. Существует множество способов оценки цитотоксического действия. Один из них - определение числа живых и погибших клеток.
Оценка целостности клеточной мембраны является одним из наиболее распространенных способов измерить жизнеспособность клетки и цитотоксические эффекты. Соединения, обладающие цитотоксичностью, часто вызывают нарушение целостности клеточной мембраны, что можно установить с помощью витального окрашивания трипановым синим или йодидом пропидия, которые свободно проникают через поврежденную мембрану и окрашивают внутриклеточные компоненты, но в здоровых клетках отсутствуют [18]. Целостность мембран может быть оценена другим способом - путем определения лактатдегидрогеназы, имеющей в норме внутриклеточную локализацию, во внешней среде [19]. Цитотоксичность может также быть определена с использованием MTT теста, основанного на способности митохондриальных дегидрогеназ конвертировать водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид (МТТ) в формазан. Подобный тест, основанный на окислительно-восстановительном потенциале, был разработан с применением флуоресцентного красителя - диазорезорцина. В дополнение разработан тест in vitro с АТФ в качестве маркера жизнеспособности [20].
Доказана неодинаковая чувствительность к наночастицам различных линий клеток, что обязательно следует учитывать при оценке цитотоксичности наночастиц.
Таким образом, иисследование цитотоксичности может включать:
.Определение повреждения мембран;
подсчет с помощью световой микроскопии поврежденных и погибших клеток, окрашенных красителем (например, трипановым синим), пассивно поступающим внутрь;
спектрофотометрическое определение живых клеток, активно захватывающих краситель (например, нейтральный красный);
лизис клеток с высвобождением внутриклеточных ферментов (например, ЛДГ) в культуральную среду, спектрофотометрическое определение (доступны диагностические наборы).
.Изучение внутриклеточных метаболических изменений;
определение активности ферментов I и II фазы биотрансформации с помощью спектрометрии, масс-спектрометрии, газовой хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и др.;
определение в МТТ-тесте нарушения функции митохондрий;
определение содержания АТФ в клетках.
. Изучение процессов апоптоза, вызывающего ряд биохимических и морфологических изменений, определяемых количественно;
каспазной активности (в частности, каспазы-3);
экспрессии Apaf-1, Bcl-2 протеинов Bax и Bid, p53.
Изучение воспалительных эффектов наноматериалов на различных культурах клеток человека in vitro необходимо для оценки потенциальной токсичности наночастиц. Цитокины, хемокины наряду с другими маркерами воспаления часто позволяют получить представление о механизме действия и токсичности наноматериалов. Использование соответствующих типов клеток человека имеет критическое значение.
Показано, что наночастицы способны проникать в клетки, минуя любые барьеры. Они способны к трансцитозу через эпителиальные и эндотелиальные клетки, распространяются по ходу дендритов и аксонов нервов, циркулируют в кровеносных и лимфатических сосудах, имеют тропность к определенным тканям. Опасение по поводу поступления наночастиц в клетки, связанное с влиянием на здоровье человека и окружающую среду, побудило исследовтелей оценивать способность наноматериалов проникать через клеточные мембраны во внутриклеточные компартменты и ядро. Чтобы оценить риск, важно определить способ воздействия и решить, способны ли данные наночастицы проникать через мембраны клеток. Перемещение можно регистрировать с помощью конфокальной флюоресцентной микроскопии, трансмиссионной электронной микроскопии.
Из-за уникальных свойств и активности, наноматериалы могут пересекать клеточные мембраны, встраиваться в ДНК, повреждать белки. Как только "входные ворота" для наноматериалов определены, культуры клеток соответствующих тканей можно изучать в отношении повреждения протеинов и ДНК. Следует отдавать предпочтение культурам клеток человека.
Среди методов in vitro, применимых для изучения генотоксичности/мутагенности наноматериалов: тест Эймса, тест на хромосомные аберрации, тест на внеплановый синтез ДНК, тест на сестринский хроматидный обмен.
Каждый из тестов может быть частичной или полной заменой для методов in vivo. Отрицательные результаты теста не требуют проведения дополнительных исследований in vivo. Кроме того, генотоксичность можно оценивать, используя другие доступные, надежные методы, например, Cоmet тест.
Таким образом, достижения в области высоких технологий, аналитических методов позволяют проводить адекватное тестирование токсичности без использования животных. Электронная микроскопия и клеточные культуры, диагностические наборы предоставляют исследователям возможность оценивать клетки/органеллы/ДНК в ходе токсикологических исследований и регистрировать химические изменения в этих структурах, вызванные наноматериалами.
С точки зрения безопасности для здоровья человека и окружающей среды необходимо, чтобы нанотоксикология строилась на фундаменте надежных, адекватных тестов in vitro, позволяющих прогнозировать эффект наноматериалов.

2. Объекты, методы исследований, приборы, оборудование

.1 Наночастицы, используемые в экспериментах in vitro

.1.1 Характеристика наночастиц серебра
Для проведения исследований использованы наночастицы серебра производства фирмы Aldrich, содержание наночастиц серебра 99,5% (следовые количества металлов), размер частиц Наименование, типЦентрифуга лабораторная ОПН-3,02Микроскоп Axioskop40Термостат ТС 80М-2 электрический суховоздушныйСушильный шкаф СНОЛ-67/350Микроскоп АУ-12Весы электронные Adventurer OHAUSИнкубатор СО2
3. Результаты исследований

.1 Влияние наночастиц серебра на жизнеспособность клеток линий А549, SHR и сублинии FL по результатам МТТ-теста

Гибель клеток, индуцированную наночастицами, оценивали по изменению оптической плотности раствора по отношению к контролю. Результаты представлены на рисунках 4.


Рисунок 4 - Влияние НЧ серебра на клетки различных линий

Как показали результаты МТТ-теста, средняя ингибиторная концентрация (IC50) наночастиц серебра - концентрация, которая на 50 % подавляет способность клеток переводить соль тетразолина в формазан, определенная графическим способом, для клеток линии А549 и сублинии FL практически совпала и составила 1,3 и 1 мг/мл соответственно. В эксперименте на кардиомиоцитах крысы IC50 наночастиц серебра определена на уровне 8 мг/мл.
Таким образом, данные, полученные в эксперименте, свидетельствуют о более высокой чувствительности клеток линий А549 и FL к действию наночастиц по сравнению с кардиомиоцитах крысы. Вероятно, это связано с более высокой скоростью деления трансформированных клеток и клеток амниона, а также интенсивностью метаболизма.

.2 Влияние наночастиц на жизнеспособность лимфоцитов человека по результатам МТТ-теста

В эксперименте на лимфоцитах человека, которые культивировали в течение 48 ч, продемонстрирована с наночастицами серебра (IC50 = 100 мкг/мл). Средняя ингибиторная концентрация определялась графически. Результаты эксперимента представлены на рисунках 5.


Рисунок 5 - Влияние НЧ серебра на лимфоциты человека

Сопоставив результаты МТТ-теста на лимфоцитах человека и предыдущего эксперимента, можно сделать вывод о том, что НЧ серебра для лимфоцитов на порядок токсичнее, чем для любой использованной ранее культуры клеток.

3.3 Изучение цитотоксичности наноматериалов для клеток линии А549 с помощью окраски метиленовым синим

Клетки линии А549 высевали в 24-луночные планшеты, куда вносили НЧ серебра. Для оценки жизнеспособности клеток использовали 0,4 % раствор метиленового синего. Окрашивание проводили через 8 и 24 ч после внесения наночастиц. Подсчет числа клеток проводили в 5 произвольных полях зрения, рассчитывали среднее значение Результаты эксперимента представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Влияние НЧ серебра в различных концентрациях на жизнеспособность клеток линии А549

Вариант опыта	Число клеток
	8 ч	24 ч.
	Общее число клеток	Число окрашенных клеток	% гибель	Общее число клеток	Число окрашенных клеток	% гибель
НЧ серебра, 100 мкг/мл	67,2	4,6	6,8	88,4	5,6	6,3
НЧ серебра, 300 мкг/мл	74	29	37,3	42,2	32,6	77,2

Показано, что при увеличении времени воздействия эффект наночастиц серебра на клетки возрастает.
Можно сделать вывод о применимости метода окраски клеток в культуре метиленовым синим для определения цитотоксического действия НЧ путем оценки целостности мембран клеток.

3.4 Изучение жизнеспособности клеток в культуре по активности лактатдегидрогеназы в среде культивирования

Изучена активность лактатдегидрогеназы (далее - ЛДГ) в среде культивирования клеток А549 при добавлении НЧ серебра в концентрациях от 100 до 1000 мкг/мл, экспозиция составила 24 ч (таблицы 3).

Таблица 3 - Результаты изучения влияния НЧ серебра на активность ЛДГ в среде культивирования клеток линии А549

Концентрация НЧ, мкг/мл	Активность ЛДГ, мЕ/мл
100	278
300	302
600	366
800	414
1000	420

В результате активность ЛДГ при максимальных концентрациях наноматериала возрастала в 1,5 раза.

Заключение

Наиболее перспективными объектами для изучения являются наночастицы серебра т.к. установлено, что наночастицы серебра являются одним из наиболее перспективных типов наночастиц металлов. По меньшей мере, 235 видов товаров народного потребления, включая зубную пасту, перевязочные материалы, средства для депиляции, содержат наносеребро. Вероятно, наночастицы серебра найдут широкое применение в производстве текстиля, косметических средств, антисептиков, полимеров, лакокрасочных материалов. Их производство и сфера применения увеличиваются, что может привести к негативному воздействию на здоровье человека и окружающую среду.
В MTT тесте среднесмертельная концентрация наночастиц серебра для клеток линии А549 и сублинии FL практически совпала и составила 1,3 и 1 мг/мл соответственно, что на порядок выше, чем среднесмертельная концентрация для лимфоцитов человека. В эксперименте на кардиомиоцитах крысы LC50 наночастиц серебра определена на уровне 8 мкг/мл.
В эксперименте на клетках линии А549 оценивали пригодность окраски трипановым синим для определения числа погибших (с нарушенной проницаемостью мембраны) клеток. Число погибших клеток, определенное по числу окрашенных клеток, оказалось несколько завышенным по сравнению с результатами подсчета разницы между живыми клетками в контроле и в опыте после смывания округлившихся и открепленных клеток. Можно сделать вывод о применимости метода окраски клеток в культуре метиленовым синим для определения цитотоксического действия НЧ путем оценки целостности мембран клеток.
При изучении влияния наноматериалов на целостность мембраны клеток установлено, что активность ЛДГ при максимальных концентрациях наноматериалов возрастала в 1,5 раза.
Список литературы

1. KemI (2008) Nanotechnology - high risk with small particles? / KemI Report 6/07. - Swedish Chemicals Agency, 2008. - 74 p.
. Toxic potential of materials at the nanolevel / A. Nel [at al.] // Science. - 2006. - N 5761, Vol. 311. - P. 622 - 627.
. Webster, T.J. Nanotechnology for the regeneration of hard and soft tissues / T.J. Webster. - Singapore, 2007. - P. 207-214.
Air pollution, oxidative stress and dietary supplementation: A review / I. Romieu [et al.] // European respiratory journal. - 2008. - Vol. 31. - P. 179-197
. Pulmonary applications and toxicity of engineered nanoparticles / J. Card [et al.] // Aamerican journal of physiology and lung cell molecular physiology. - 2008. - Vol. 295. - P. 400-411.
. Long-term air pollution exposure is associated with neuroinflammation, an altered innate immune response, disruption of the blood-brain barrier, ultrafine particulate deposition, and accumulation of amyloid β-42 and α-synuclein in children and young adults / L. Calderón-Garcidueñas [et al.] // Toxicologic pathology. - 2008. - Vol. 36. - P. 289-310.
7. Seaton, A. Nanotechnology and the occupational physician / A. Seaton // Occupational medicine. - 2006. - Vol. 56, N 5. - P. 312-316.
. The toxicity of diesel exhaust: implications for primary care / I. Krivoshto [et al.] // Journal of the American board of family medicine. - 2008. - Vol. 21, N1. - P. 55-62.
. Assessing toxicity of fine and nanoparticles: comparing in vitro measurements to in vivo pulmonary toxicity profiles / C.M. Sayes [et al.] // Toxicological sciences. - 2007. - Vol. 97, N1. - P. 163-180.
. Dreher, K.L. Health and environmental impact of nanotechnology: toxicological assessment of manufactured nanoparticles / K.L. Dreher // Toxicological sciences. - 2004. - Vol. 77. - P. 3-5.
. Meng, H. A predictive toxicological paradigm for the safety assessment of nanomaterials / H. Meng et al. // ACS. - 2009. - Vol. 3, N 7. - P. 1620-1627.
Riss, T.L., Moravec, R.A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays / T.L. Riss, R.A. Moravec // Assay Drug Dev. Technol. - Vol. 2, N 1. - P. 51-62.
. Decker, T., Lohmann-Matthes, M.L. A quick and simple method for the quantitation of lactate dehydrogenase release in measurements of cellular cytotoxicity and tumor necrosis factor (TNF) activity / T. Decker, M.L. Lohmann-Matthes // J. Immunol. Methods. - Vol. 115, N 1. - P. 61-69.
. Культура животных клеток. Методы: пер. с англ. / под ред. Р. Фрешни. - М.: Мир, 1989. - 333 с.
. Комплексная биологическая оценка объектов природного и искусственного происхождения на Tetrahymena pyriformis: метод. рекомендации / разраб.: Белорус. науч.-иссл. сан.-гиг. ин-т; авт.-сост. А.С. Богдан. - Минск, 1996. - 19 с.
. Maron, D.M. Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test / D.M. Maron, B.N. Ames // Mutat. Res. - 1983. - Vol. 113, N 3-4. - P. 173-215.
. OECD Guideline 471, Bacterial Reverse Mutation Test, updated and adopted July 21, 1997.
18. Фонштейн, Л.М. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем: Методические указания / Л.М. Фонштейн [и др.]. - М., 1985. - 34 с.
. Гузев, B.C., Левин, C.B. Техногенные изменения сообщества почвенных микроорганизмов / B.C. Гузев, C.B. Левин // Тез. докл. конф. «Перспективы развития почвенной биологии». - Москва, 2001. - С. 178-219.